Restriction Mapping Double Digest Problem

1. Warum gibt es doppelte Verdauungsbeschränkungen??
2. Warum funktioniert mein Restriktionsverdau nicht??
3. Was passiert, wenn Sie zu viel Restriktionsenzym hinzufügen??
4. Können zwei Restriktionsenzyme an derselben Stelle schneiden??
5. Wie berechnet man den Restriktionsverdau??
6. Wie lange sollte eine Restriktionsverdauung dauern??
7. Ist eine Hitzeinaktivierung von Restriktionsenzymen notwendig??
8. Laufen Restriktionsenzyme ab??
9. Wie kann eine Restriktionsverdauung verhindert werden??
10. Warum sollte ein Restriktionsenzym nicht schneiden??
11. Wie wählt man Restriktionsenzyme aus??
12. Warum müssen Restriktionsenzyme auf Eis gehalten werden??

Warum gibt es doppelte Verdauungsbeschränkungen??

Das gleichzeitige Verdauen eines DNA-Substrats mit zwei Restriktionsendonukleasen (Doppelverdauung) ist ein übliches zeitsparendes Verfahren. Die Auswahl des besten NEBuffers zur Bereitstellung von Reaktionsbedingungen, die die Enzymaktivität optimieren und die mit einigen Enzymen verbundene Sternaktivität vermeiden, ist eine wichtige Überlegung.

Warum funktioniert mein Restriktionsverdau nicht??

Unvollständige oder keine Verdauung aufgrund von durch DNA-Methylierung blockierter Enzymaktivität. Wenn Ihr Enzym aktiv ist und die Kontroll-DNA verdaut und die Reaktion unter optimalen Bedingungen aufgebaut wird, Sie jedoch weiterhin Probleme mit der Verdauung sehen, kann dies daran liegen, dass das Enzym durch Methylierung der Matrizen-DNA gehemmt wird.

Was passiert, wenn Sie zu viel Restriktionsenzym hinzufügen??

Eine unvollständige Verdauung kann auftreten, wenn zu viel oder zu wenig Enzym verwendet wird. Das Vorhandensein von Verunreinigungen in der DNA-Probe kann die Enzyme hemmen, was ebenfalls zu einer unvollständigen Verdauung führt.

Können zwei Restriktionsenzyme an derselben Stelle schneiden??

Sie können geeignete Kontrollen wie die Verdauung mit nur einer Restriktion und beide Enzyme zusammen durchführen, um sicherzustellen, dass beide unabhängig voneinander und auch zusammen schneiden, und Ihre Pläne umsetzen. Leider war ich auf diese beiden Enzyme beschränkt, die zufällig Stellen nebeneinander hatten!

Wie berechnet man den Restriktionsverdau??

Berechnen Sie die Menge von jedem, die Sie zu einem Restriktionsverdau hinzufügen müssen, um 5 ug (5000 ng) DNA mit 5 Einheiten Enzym zu verdauen. Wenn meine DNA beispielsweise bei 190 ng / ul liegt, würde ich Folgendes benötigen: 5000 ng / 190 ng / ul = 26 ul meiner Probe.

Wie lange sollte eine Restriktionsverdauung dauern??

* Pro-Tipp * Abhängig von der Anwendung und der Menge an DNA in der Reaktion kann die Inkubationszeit zwischen 45 Minuten und über Nacht liegen. Für diagnostische Verdauungen reichen oft 1-2 Stunden aus. Für Verdauungen mit >1 µg DNA zum Klonen verwendet. Es wird empfohlen, mindestens 4 Stunden zu verdauen.

Ist eine Hitzeinaktivierung von Restriktionsenzymen notwendig??

FAQ: Ist es notwendig, Restriktionsenzyme nach dem Vektorverdau zu inaktivieren? Die Inaktivierung von Restriktionsendonukleasen ist im Allgemeinen nicht erforderlich, kann jedoch in einigen Fällen die Transformationseffizienz erhöhen.

Laufen Restriktionsenzyme ab??

Alle Enzyme werden alle 3-6 Monate auf Aktivität getestet; Das Verfallsdatum ist auf dem Etikett angegeben, das jedem Enzymfläschchen beigefügt ist. Nach 35 Jahren Erfahrung mit Restriktionsenzymen haben wir festgestellt, dass die meisten bei Lagerung bei -20 ° C im empfohlenen Lagerungspuffer sehr stabil sind.

Wie kann eine Restriktionsverdauung verhindert werden??

Restriction Enzyme Digest Protocol

1. Fügen Sie einem sauberen Rohr Komponenten in der angegebenen Reihenfolge hinzu: ...
2. Inkubieren Sie die Reaktion 1 Stunde lang bei Verdauungstemperatur (normalerweise 37 ° C).
3. Stoppen Sie den Aufschluss durch Hitzeinaktivierung (65 ° C für 15 Minuten) oder Zugabe von 10 mM EDTA-Endkonzentration.
4. Die verdaute DNA kann in Forschungsanwendungen eingesetzt werden.

Warum sollte ein Restriktionsenzym nicht schneiden??

FAQ: Warum schneidet mein Restriktionsenzym keine DNA? ... Wenn die Kontroll-DNA gespalten wird und die experimentelle DNA der Spaltung widersteht, können die beiden DNAs gemischt werden, um festzustellen, ob in der experimentellen Probe ein Inhibitor vorhanden ist. Wenn ein Inhibitor (häufig Salz, EDTA oder Phenol) vorhanden ist, schneidet die Kontroll-DNA nach dem Mischen nicht.

Wie wählt man Restriktionsenzyme aus??

Bei der Auswahl von Restriktionsenzymen möchten Sie Enzyme auswählen, die:

1. Flankieren Sie Ihren Einsatz, aber schneiden Sie nicht in Ihren Einsatz hinein.
2. Befinden sich an der gewünschten Stelle in Ihrem Empfängerplasmid (normalerweise an der Multiple Cloning Site (MCS)), schneiden Sie jedoch nicht an anderer Stelle auf dem Plasmid.

Warum müssen Restriktionsenzyme auf Eis gehalten werden??

Müssen Enzyme wirklich die ganze Zeit auf Eis gehalten werden? ... Enzyme müssen bei optimalen Temperaturen gelagert und verwendet werden. Enzyme werden im Allgemeinen bei -20 ° C in Glycerin gelagert. Dies verhindert, dass sie vollständig einfrieren, was zu einer Denaturierung des Proteins führt und zu einem Aktivitätsverlust führt.